Tổng quan western blot là gì, phương pháp xét nghiệm western blot
Western Blot là 1 trong kỹ thuật so sánh được sử dụng rộng rãi nhằm mục đích vạc hiện tại các protein siêng biệt bên trên các mẫu mã tế bào xuất xắc dịch chiết xuất tế bào.quý khách sẽ xem: Western blot là gì
Phương thơm pháp này áp dụng năng lượng điện di bên trên gel nhằm phân tách các protein còn nguim vẹn bằng kết cấu 3D xuất xắc protein sẽ trở thành tính theo độ nhiều năm của mạch polypeptide. Protein này tiếp nối sẽ được đưa lên màng (thường sử dụng là màng nitrocellulose giỏi màng PVDF), sống kia bọn chúng được gắn thêm bởi các kháng thể quánh hiệu với protein kim chỉ nam. Điện di bên trên gel sẽ tiến hành chuyển vào khối hệ thống so với Western Blot nhằm mục tiêu giải quyết và xử lý các sự việc của các phản bội ứng chéo cánh giữa các kháng thể.
Bạn đang xem: Tổng quan western blot là gì, phương pháp xét nghiệm western blot
Nguồn ảnh: http://proteomics.case.edu/proteomics/westernblot.html
1. Nguim lý
Western Blot là chuyên môn lai thân protein với protein (Kháng ngulặng Kháng thể). Protein chống nguim được phân phát hiện tại qua phản bội ứng chế tạo ra màu hoặc phân phát huỳnh quang
2. Các bước thực hiện:
Bước 1: Xử lý mẫu
Lấy chủng loại từ toàn thể tế bào xuất xắc môi trường xung quanh nuôi ghép tế bào. Trước hết, cách xử lý mô rắn bởi phương thức cơ học tập sử dụng trang bị nghiền, thực hiện thiết bị đồng điệu hoặc rất âm. Những mẫu mã virut giỏi mẫu rước trừ trong môi trường xung quanh nuôi cấy cũng có thể là mối cung cấp protein xác định được trong Western Blot. Thêm các một số loại chất tẩy cọ, muối với dung dịch đệm để ly giải tế bào và hòa tan protein
Cách 2: Điện di trên gel
Điện di trên gel để phân bóc tách những protein trong mẫu mã. Sự phân tách bóc này của protein dựa vào điểm đẳng điện, khối lượng phân tử, năng lượng điện hoặc phối kết hợp các nhân tố bên trên.
Phương thơm pháp điện di phổ biến độc nhất vô nhị là năng lượng điện di bên trên gel polyacrylamide và gồm bổ sung sodium dodecyl sulfate (SDS). Phương pháp SDS PAGE (điện di trên gel polyacrylamide với bao gồm bổ sung SDS) giữ những polypeptide sinh hoạt tâm trạng trở thành tính sau thời điểm bọn chúng được xử trí cùng với chất khử táo bạo cùng thiếu tính kết cấu bậc 2, kết cấu bậc 3.
Bước 3: Chuyển protein gel lên màng lai
Để những protein có thể phát hiện được chống thể thì protein nên được gửi trường đoản cú gel lên màng lai. Phương thơm pháp chủ yếu nhằm chuyển những protein được Call là phương thức thđộ ẩm bóc tách điện là sử dụng một cái năng lượng điện để kéo các protein từ bỏ gel lên màng PVDF hoặc màng nitrocelluchiến bại. Các protein được đưa lên màng nhưng vẫn bảo trì sự bố trí như bên trên phiên bản gel. Kết quả là protein sẽ được phơi ra bên trên lớp mỏng bề mặt để thực hiện xác định
Bước 4: Xử lý màng lai (Blocking)
Do kháng thể và protein đích gần như là protein, phải thường xuyên thực hiện các bước nhằm ngăn chặn link giữa màng với phòng thể được sử dụng để xác định protein phương châm. Việc ngăn ngừa các links ko quánh hiệu bằng cách đặt màng vào dung dịch protein loãng albumin máu tương trườn 3-5 % (BSA) hoặc sữa bột ko lớn trong Tris Buffered saline (TBS). Protein trong dung dịch loãng sẽ lắp với màng sinh hoạt tất cả các vị trí nhưng mà protein đích chưa tích hợp. Do đó lúc kháng thể được bổ sung vào, sẽ không còn địa điểm bám dính trên màng ngoại trừ những địa chỉ link quánh hiệu với protein đích. Điều này làm sút nhiễu cơ bản trong sản phẩm cuối cùng của Western Blot, cho tác dụng ví dụ với ngoài hiện tượng lạ dương tính mang.
Xem thêm: Spiderum Là Gì Cả, Chỉ Là Bản Lề Của Một Cánh Cửa Lớn, Spiderum Là Gì
Cách 5: Quá trình lai và phạt hiện vị trí lai
Để vạc hiện tại những protein chăm biệt, màng được dò protein quan tâm bởi phòng thể đã chuyển đổi có khả năng link với enzyme thông tin, enzyme này lúc kết hợp với một cơ chất khớp ứng đã ảnh hưởng phản ứng kêt nạp quang quẻ và sản xuất color. Quá trình này ra mắt tất cả 2 bước:
– Màng lai đó đã cố định protein được lai cùng với phòng thể sơ cấp cho. Kháng thể sơ cấp cho là 1 trong phòng thể đặc hiệu được tao ra Lúc mang lại đồ vật nhà xuất xắc môi trường thiên nhiên nuôi ghép tế bào miễn dịch tiếp xúc cùng với protein quyên tâm.
– Sau Khi cọ màng nhằm vứt bỏ kháng thể sơ cung cấp chưa link, màng tiếp tục lắp phòng thể sản phẩm nhị (chống thể máy cấp) bao gồm gắn enzyme (hay sử dụng horseradish peroxidase). Tiếp tục ủ màng lai trong một tất cả hổn hợp phản bội ứng quánh hiệu với enzyme. Đặt một tấm phlặng ngạy cảm cùng với tia X lên màng lai nhằm vạc hiện tại những đặc điểm phạt ra bởi vì enzyme.
cũng có thể thực hiện các phương pháp nhằm phát hiện nay chống thể vật dụng cấp: thực hiện sự phản xạ hồng ngoại sát link cùng với phòng thể gắn hóa học huỳnh quang, sử dụng đánh dấu phóng xạ
3. Ứng dụng:
Xác định sự buổi giao lưu của gel trải qua sự có mặt của protein trong môNhận dạng protein mục tiêuĐánh giá chỉ tính chuyên biệt của phòng thểPhân tích bệnh dịch vị vi khuẩn với vi khuẩn gây ra: nghiên cứu xác minh HIV, viêm gan BNăm 2002, đang áp dụng thành công phương thức Western Blot trong việc xác minh kháng nguyên ổn giun đũa chó (Toxocara canis) bên trên thỏ (Olga Lucia Morales cùng ctv, 2002), xuất hiện một hướng đi new trong câu hỏi xét nghiệm chẩn đoán đúng chuẩn các bệnh dịch ký kết sinc trùng trên tín đồ.
ThS. Đỗ Thị Phượng Linh
Tài liệu tđắm đuối khảo
Olga Lucia Morales, 2002. Identification of Toxocara canis antiren by Western Blot in experimentally infected rabbits. Rev. Inst. Med.trop. S. Paulo 44 (4):213 216.
Video liên quan
